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Cell Death & Disease volumen 14, Número de artículo: 319 (2023) Citar este artículo

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Se ha establecido una fuerte correlación entre la expresión tumoral de NOS2 y COX2 y los malos resultados clínicos en el cáncer de mama ER. Sin embargo, los mecanismos de inducción tumoral de estas enzimas no están claros. El análisis de The Cancer Genome Atlas (TCGA) reveló correlaciones entre la expresión de NOS2 y COX2 y las citoquinas Th1. En este documento, el análisis de RNAseq de una sola célula de células TNBC muestra una potente inducción de NOS2 y COX2 por IFNγ combinado con IL1β o TNFα. Dado que el IFNγ es secretado por los linfocitos citolíticos, lo que mejora los resultados clínicos, este papel del IFNγ presenta una dicotomía. Para explorar este enigma, las células T tumorales NOS2, COX2 y CD8+ se analizaron espacialmente en tumores de mama agresivos ER–, TNBC y HER2+. Se produjo una alta expresión y agrupación de células tumorales que expresan NOS2 en la interfaz tumor/estroma en presencia de células T CD8+ restringidas por estroma. La alta expresión y el agrupamiento de células tumorales que expresan COX2 se extendieron a las regiones desérticas inmunitarias en el núcleo del tumor donde la penetración de las células T CD8+ era limitada o estaba ausente. Además, las células tumorales con alta expresión de NOS2 estaban próximas a áreas con mayor satelitosis, lo que sugiere grupos de células con un mayor potencial metastásico. Otros experimentos in vitro revelaron que IFNγ + IL1β/TNFα aumentaron el alargamiento y la migración de las células tumorales tratadas. Este análisis espacial del microambiente tumoral proporciona información importante sobre distintos vecindarios donde existen células T CD8+ restringidas por estroma proximales a nichos tumorales que expresan NOS2 que podrían haber aumentado el potencial metastásico.

El cáncer de mama con receptor de estrógeno alfa negativo (ER-) y triple negativo (TNBC) representan una proporción más pequeña de los tipos de cáncer de mama, pero se encuentran entre las neoplasias malignas más agresivas con estrategias de tratamiento limitadas en comparación con los tumores ER+ menos agresivos [1]. Durante la última década, una proporción significativa de cánceres ha demostrado una expresión elevada de NOS2 [2], donde los cánceres que van desde el melanoma hasta el glioma sobreexpresan NOS2 [3,4,5,6]. En el cáncer de mama, se ha notificado un aumento de NOS2 en >70 % de los pacientes [7]. Curiosamente, la expresión elevada de NOS2 en el tumor se correlacionó con la mutación P53 y predijo una supervivencia deficiente en pacientes con cáncer de mama ER− (Hazard Ratio = 6) pero no ER+ [7, 8]. Si bien la expresión elevada de COX2 en el tumor también fue predictiva de un mal resultado definido por un HR de 2,45 en pacientes con RE de la misma cohorte [9], la coexpresión elevada de NOS2/COX2 fue fuertemente predictiva de un mal resultado (HR 21) [10]. Estos resultados sugieren que la coexpresión tumoral elevada de NOS2/COX2 impulsa la progresión de los fenotipos agresivos de cáncer de mama [10, 11]; sin embargo, los mecanismos de inducción de NOS2/COX2 dentro de los tumores siguen sin estar claros.

El examen de The Cancer Genome Atlas (TCGA) ha revelado correlaciones entre la expresión tumoral de NOS2/COX2 e interferón-gamma (IFNγ), interleucina-17 (IL17), IL1 y receptor tipo toll-4 (TLR4), que se asocian con frecuencia con efectos anticancerígenos [12]. Curiosamente, estas asociaciones son contradictorias, ya que la expresión elevada de NOS2/COX2 en el tumor predice malos resultados clínicos [7, 9, 10]. Recientemente, se descubrió una expresión elevada de NOS2 y COX2 en distintas células inmunitarias y tumorales tras el tratamiento con IFNγ y citocinas o agonistas de TLR4, en consonancia con la señalización anticipada de NOS2/COX2 como se informó anteriormente [10, 13]. Estos resultados sugieren una relación ortogonal entre la expresión de NOS2/COX2 en el tumor, lo que podría promover distintos microambientes tumorales que contribuyen a resultados clínicos deficientes [13].

Para explorar estas posibilidades, aquí, mostramos que las citocinas Th1 estimulan efectivamente la expresión de NOS2 y COX2 en células tumorales in vitro. El análisis de RNAseq de una sola célula (scRNAseq) reveló que el IFNγ combinado con la interleucina 1β (IL1β) o el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) inducían una mayor expresión de NOS2/COX2 que las citoquinas como agentes individuales. Además, estos tratamientos indujeron citoquinas que estaban reguladas al alza en tumores de mama ER con alta expresión de NOS2 [7, 10], incluidas IL6 e IL8, y se correlacionaron con la expresión de NOS2/COX2. Además, este estudio revela una sinergia única entre IL1α/β que mejora la expresión de NOS2 y COX2. Las imágenes espaciales multiplex revelaron grupos de células con alta expresión de NOS2 proximales a áreas de células T CD8+ restringidas por estroma que se sabe que producen IFNγ y sugieren un pequeño nicho inflamatorio en la interfaz tumor/estroma en estos tumores. Si bien la COX2 estuvo presente en estas regiones, se expresó más intensamente más adentro del tumor, en áreas desérticas inmunitarias con baja penetración de células T CD8+. La comparación de sitios distintos dentro del mismo tumor, o regiones geográficas entre tumores, sugiere una progresión espacial y temporal de sitios inflamatorios en áreas de células linfoides restringidas, que progresa a un desierto inmunológico en áreas de alta expresión de COX2. Estas nuevas observaciones proporcionan huellas dactilares espaciales distintas de fenotipos tumorales agresivos que se correlacionan con una disminución de la supervivencia del cáncer de mama específico de la enfermedad [7, 10].

Nuestro trabajo anterior que comparó la expresión tumoral alta y baja de NOS2 y COX2 (también conocida como PTGS2) reveló asociaciones con una variedad de marcadores inflamatorios que generalmente están asociados con la actividad antitumoral [10], lo que nos llevó a explorar los efectos reguladores de las citocinas en la expresión de NOS2/COX2 en células y tejidos tumorales. Se realizó un análisis de correlación utilizando el navegador Xena y la base de datos TCGA para obtener una comprensión más profunda de las condiciones asociadas con las expresiones de NOS2 y COX2 en el cáncer de mama ER. El análisis de correlación de TCGA-BRCA (cáncer de mama) reveló varias vías inflamatorias asociadas con una mayor expresión tumoral de NOS2/COX2 (Fig. 1A) que influyeron en los resultados clínicos (Fig. 1B), incluidos los IFNγ, TNFα, IL2, IL1 asociados con antitumorales. , e IL17 (Fig. 1A). Además, las expresiones tumorales de NOS2/COX2 se correlacionaron positivamente y las citoquinas Th1 tuvieron la asociación positiva más fuerte con COX2, mientras que IL1β se asoció con NOS2 (Fig. 1A). Estos hallazgos sugieren una dicotomía dentro del microambiente tumoral (TME), donde las citoquinas que generalmente se asocian con resultados favorables también promueven expresiones tumorales elevadas de NOS2/COX2 (Fig. 1A), que son fuertes predictores de supervivencia pobre específica de la enfermedad en ER-mama. pacientes con cáncer (Fig. 1B) [7, 9, 10]. Para confirmar las funciones reguladoras de estas citocinas en la inducción de expresiones de NOS2 y/o COX2, se estimularon células de cáncer de mama MDA-MB231 (MB231) con IFNγ en presencia y ausencia de TNFα, IL1β, IL17 y TLR4. lipopolisacárido agonista (LPS). Los datos de RNAseq de una sola célula revelaron que la exposición de 48 h a IFNγ combinado con TNFα o IL1β indujo las expresiones más altas de NOS2 y COX2 (Fig. 1C). De acuerdo con informes previos en tumores murinos [12], la alta expresión de NOS2 requiere IFNγ y TNFα/IL1, que muestran una diferencia sorprendente en las citoquinas producidas durante la inducción de macrófagos murinos y células tumorales [12]. Además, scRNAseq de células MB231 estimuladas con citocinas reveló que una estimulación de 48 h con IFNγ en presencia de IL1β o TNFα indujo las expresiones más altas de NOS2 y COX2, que se agruparon en las mismas regiones de la gráfica t-SNE (Fig. 1C, D ). Estos resultados confirman que la expresión alta de NOS2 y COX2 es inducida por IFNγ combinado con IL1β o TNFα como se muestra en el análisis TCGA. Como se predijo, el análisis de scRNAseq de IFNγ + IL1β/TNFα reveló un aumento en los niveles de transcripción de NOS2 y COX2 en las células MB231 tratadas. El número de transcripciones de NOS2 varió de 1 a 3, mientras que las transcripciones de COX2 tenían un rango significativamente más amplio (Fig. 1D). Mientras que menos del 9 % de las células contenían transcritos de NOS2, hasta el 40 % de las células contenían transcritos de COX2 (Fig. 1D). La expresión de NOS2 requirió IFNγ, mientras que la expresión de COX2 fue débilmente inducida por IL1β o TNFα solos (Fig. 1D). No obstante, de manera similar a NOS2, la expresión más fuerte de COX2 ocurrió con IFNγ + IL1β/TNFα. Además de la estimulación de las citoquinas, la señalización de retroalimentación de NOS2/COX2 también podría promover una expresión elevada de NOS2/COX2 (Fig. 1A), como se informó anteriormente [10].

Visualización de mapa de calor AA del análisis de correlación de Pearson de la base de datos TCGA-BRCA (n = 1248) a través del navegador UCSC Xena que analiza Th1, Th2, Th17 y dos genes GOI (gen de interés). El mapa de calor se generó en corrplot (0.92) en R (4.2.1). B Análisis de supervivencia asociado con las expresiones de la proteína tumoral NOS2lo/COX2hi (flecha azul), NOS2lo/COX2lo (flecha verde), NOS2hi/COX2lo (flecha amarilla) y NOS2hi/COX2hi (flecha roja). Gráfica C t-SNE (Loupe Browser 6.3.0) del análisis de una sola célula de células MB231 tratadas con una sola o una combinación de citoquinas IFNγ (100 U/ml), IL1β (10 ng/ml), TNFα (10 ng/ml) , IL17 (100 ng/ml) y LPS (10 ng/ml) durante 24 y 48 h. Los grupos de color verde claro y verde oscuro representan puntos de tiempo de 24 y 48 h asociados con el tratamiento con IFNγ + IL1β/TNFα, respectivamente. El círculo naranja indica el mayor agrupamiento de células superpuestas para IFNγ + IL1β o TNFα después de 48 h de tratamiento. D Gráficos de t-SNE de células de agrupación NOS2 y COX2. Los gráficos de barras apiladas muestran el número de transcripciones de NOS2 y COX2 por célula en grupos de tratamiento de 48 h. Los datos de transcripción por celda (código de color: azul, 1; naranja, 2; gris, 3; amarillo, 4; cian, 5; verde, 6) se extrajeron utilizando los paquetes R (data.table 1.14.2, dplyr 1.0.10 y ggplot2 3.3.6).

Se han informado marcadores de tallo del cáncer en poblaciones celulares con niveles elevados de expresión de CD44 y reducidos de CD24 que exhibieron las mismas características histopatológicas resistentes a los medicamentos del tumor derivado cuando se inyectaron en ratones en concentraciones muy bajas [14]. En este documento, el análisis del gráfico t-SNE de la expresión de CD44/CD24 reveló distintos patrones de agrupamiento (Fig. 2A) definidos por niveles aumentados de CD44 y reducidos de CD24 en grupos con alta expresión de NOS2/COX2 después de 48 h de tratamiento con IFNγ + IL1β o TNFα. Este patrón es sugestivo de un aumento de la troncalidad del cáncer [14] y es consistente con informes anteriores de niveles elevados de CD44 en tumores de mama ER- que expresan NOS2 alto [7, 15]. La expresión del inhibidor de tejido metaloproteinasa-1 (TIMP1), un marcador de fibrosis [16], fue similar a CD44, lo que indica que sus expresiones probablemente estaban controladas por el mismo regulador aguas arriba (Fig. 2A). Para explorar las relaciones de expresión entre las citoquinas Th1, analizamos los patrones de agrupación de IL6, IL8, IL1α e IL1β (Fig. 2B). Los patrones de agrupación de estas citoquinas son muy similares y se superponen fuertemente después de 48 h de estimulación con IFNγ + IL1β/TNFα (Fig. 2B). Además, el examen de otros genes inducidos por citoquinas reveló una fuerte asociación con IL1α/β (Fig. 2C) y son consistentes con las observaciones que demuestran que la IL1β circulante predice una pobre supervivencia [17]. Juntos, estos hallazgos respaldan el análisis de correlación TCGA-BRCA que se muestra en la figura 1A.

Un gráfico t-SNE de marcadores de células madre cancerosas (CD24/CD44) y fibrosis (TIMP1) y marcadores de citocinas B Th1 (IL6, IL8, IL1β, IL1α), que se agruparon en las mismas regiones que NOS2/COX2 que se muestran en el panel A. C Análisis de correlación de citocinas seleccionadas, marcadores de células madre cancerosas y genes asociados con metástasis. Los datos se extrajeron de los grupos tratados con Control, IFNγ, IL1β e IFNγ + IL1β en corrplot (0.92) en R (4.2.1) durante 48 h. NOS2 no se expresó en las células Control y tratadas con IL1β y, por lo tanto, no está representado en el análisis de correlación.

Los hallazgos in vitro anteriores demuestran que IFNγ es un regulador clave en la inducción de la expresión de NOS2/COX2 en células tumorales de mama ER-, lo que plantea la cuestión del origen de la secreción de IFNγ en tejidos tumorales. Los linfocitos citotóxicos liberan IFNγ y se asocian con una mejor supervivencia en TNBC y otros tipos de cáncer [18,19,20]. Por el contrario, la expresión elevada de NOS2/COX2 en el tumor promueve la progresión de la enfermedad y es un fuerte predictor de supervivencia deficiente del cáncer de mama específico de la enfermedad [7, 9, 10]. Estos hallazgos implican una dicotomía en la que las células IFNγ productoras de linfoides antitumorales podrían inducir nichos celulares que expresan NOS2/COX2 protumorales, lo que puede deberse a la heterogeneidad dentro del TME. Para explorar esta hipótesis, se examinó la proximidad espacial y la relación entre las células T CD8+ que producen IFNγ y las células tumorales que expresan NOS2/COX2 en 21 tumores de mama ER- (incluidos TNBC (n = 14) y HER2/neu+ (n = 7 ) fenotipos) utilizando imágenes espaciales multiplex. Las imágenes de fluorescencia permiten la visualización y cuantificación de vecindarios celulares a nivel de una sola célula. Se observaron células que expresaban NOS2 y COX2 en distintas regiones del TME, como se muestra en la Fig. 3A. Los análisis de mapa de calor de densidad y distribución espacial de todo el tumor revelan distintas regiones de células T NOS2, COX2 y CD8+ donde se observaron células que expresan NOS2 y COX2 (Fig. 3B, C) en vecindarios separados. Además, se observaron densidades de células T CD8+ más altas cerca de las células que expresan NOS2, mientras que se identificaron densidades más bajas cerca de los grupos que expresan COX2 (Fig. 3B, C). Por lo tanto, las células que expresan NOS2 y COX2 espacialmente distintas en relación con las células T CD8+ en tumores de mama agresivos sugieren una asociación entre las células T CD8+ y los nichos NOS2/COX2 inducidos por citocinas que influyen en los resultados clínicos.

Fluorescencia múltiplex de un tumor de mama ER-/HER2+ que muestra NOS2 (rojo), COX2 (verde), CKSOX10 (azul), células T CD8+ (magenta) y DAPI (blanco). B Distribución espacial (izquierda) y mapas térmicos de densidad (derecha) de linfocitos T NOS2, COX2 o CD8+. Las distribuciones espaciales reflejan una detección positiva de los marcadores dentro de áreas de 25 µm de diámetro independientemente de la cantidad. Los mapas de calor de densidad proporcionan una cuantificación visual reflejada por la gradación de color (bajo-alto) azul, verde, amarillo, naranja y rojo de las expresiones de proteínas biomarcadoras. C comparación de las combinaciones de distribución espacial de NOS2/CD8, COX2/CD8 y NOS2/COX2.

Las expresiones de NOS2/COX2 en tumores ER- previamente calificados como NOS2/COX2 alto (alto) o bajo (bajo) por inmunohistoquímica (IHC) de rutina con grados de 1 a 4 [7, 9] se analizaron para determinar la intensidad de fluorescencia de NOS2/COX2 en el nivel de una sola célula utilizando imágenes de fluorescencia multiplexada, que proporciona información espacial a nivel de una sola célula en regiones que incluyen necrosis, estroma y tumor viable. Las regiones de tumor y estroma viables fueron anotadas por un patólogo veterinario en imágenes H&E (QuPath) [21] y fusionadas con la expresión fluorescente de NOS2/COX2 usando el software HALO (Fig. 4A). Se determinaron las intensidades fluorescentes de NOS2 y COX2 para cada tumor mediante la sintonización en tiempo real en el software HALO, y luego se determinaron las intensidades medias y las desviaciones estándar (SD). Las intensidades de umbral para los niveles de expresión débil, moderado y fuerte se determinaron agregando 2, 4 o 6 DE, respectivamente, al ajuste del umbral de intensidad media. Las intensidades fluorescentes de NOS2/COX2 de todo el tumor cuantificadas a partir de estos umbrales (Fig. 1A complementaria) fueron consistentes con los niveles de expresión de NOS2/COX2 calificados por el patólogo original de IHC informados anteriormente [7, 9]. Al estratificar por tumor frente a estroma, la expresión tumoral de NOS2/COX2 con una intensidad de señal fuerte/moderada fue significativamente elevada en los tumores de alta expresión de NOS2/COX2 (Figura 1B complementaria). En contraste, las intensidades de la señal débil de NOS2 fueron significativamente elevadas en el estroma pero no en el tumor, mientras que la intensidad de la señal débil de COX2 fue mayor en el tumor pero no en el estroma (Figura 1B complementaria). Se ha demostrado que la señalización de realimentación de NOS2 y COX2 [10] mantiene sus expresiones. Se examinó una posible relación lineal entre la NOS2 del tumor y la COX2 en estos tumores mediante el coeficiente de correlación de Pearson, que reveló correlaciones lineales entre la expresión de la NOS2 y la COX2 en intensidades fuertes, moderadas y débiles (Figura 1C complementaria). Juntos, estos resultados respaldan la señalización de retroalimentación de NOS2/COX2 como se muestra en la figura 1A y como se informó anteriormente [10].

Una sección teñida con H&E (izquierda) fusionada con una imagen fluorescente en serie (derecha). Las secciones de H&E fueron evaluadas por un patólogo que definió áreas de necrosis (púrpura), tumor viable (verde) y estroma (naranja). Se muestran las células que expresan %NOS2/COX2 en todo el tumor, así como en el tumor y el estroma. B Las áreas en la distribución espacial resaltadas por cuadros azules etiquetados 1 (arriba), 2 (medio) y 3 (abajo) reflejan una progresión de (1) regiones inflamadas de células T CD8+ restringidas por estroma a (2) regiones frías con linfocitos T CD8+ restringidos por estroma y (3) regiones centrales del tumor del desierto inmune al frío que carecen de linfocitos T CD8+. Los análisis espaciales de la expresión de NOS2/COX2 en estas áreas recuadradas, así como las células T CD8+ o IFNγ, se muestran con un aumento de 50 μm. Las imágenes registradas en la región inflamada designada en el cuadro 1 muestran células T CD8+ restringidas por estroma C (cian) o expresión de IFNγ D (cian) cerca de células que expresan NOS2 (rojo). Los análisis de las regiones frías designadas en el recuadro 2 muestran una alta expresión de COX2 y una baja expresión de NOS2 con células T CD8+ limitadas por E e IFNγ limitadas por F. Los análisis de las regiones del núcleo del tumor del desierto inmunitario asociadas con el recuadro 3 muestran una alta expresión de COX2 en el tumor con niveles reducidos de células T G CD8+ y expresión reducida de H IFNγ.

La Figura 4A demuestra aumentos significativos en el % de células con expresión tumoral elevada de NOS2/COX2 en todo el tumor, así como en las regiones del tumor y del estroma. Un examen más detallado de las distribuciones espaciales de NOS2 y COX2 reveló que las células NOS2+ se agrupan en los márgenes del tumor o en el estroma (Fig. 4B-D). Si bien la expresión de COX2 se observó cerca de las células que expresan NOS2 en algunas regiones, las células COX2+ se agruparon densamente en distintas áreas más profundas en el núcleo del tumor, así como en las regiones del desierto inmunitario del tumor (Fig. 4E-H). Los tumores puntuados como NOS2lo/COX2lo exhibieron focos NOS2 y COX2 de baja densidad esporádicos, donde se observaron pocos o ningún foco de mayor intensidad. En contraste, los tumores NOS2hi/COX2hi exhibieron numerosos focos de NOS2 y COX2 de alta expresión, espacialmente distintos, con grupos de NOS2 en la interfaz tumor-estroma (Fig. 4C, D). Por el contrario, los cuadros 2 y 3 muestran grupos de COX2 que se extienden más profundamente en el núcleo del tumor (Fig. 4E-H). Por lo tanto, las células que expresan NOS2 y COX2 están espacialmente localizadas en distintas regiones inflamatorias del tumor.

Como se representa en las Figs. 1D y 2C, IFNγ es necesario para la expresión óptima de NOS2/COX2 en células tratadas con citoquinas MB231. Las células linfoides, incluidas las células T CD8+, son una fuente de secreción de IFNγ [20]. Estudios recientes han demostrado un papel clave en la orientación espacial de las células T CD8+ para mejorar la supervivencia en TNBC [22]. La penetración de las células T CD8+ en el núcleo del tumor definió un tumor completamente inflamado que predijo una mejor supervivencia de los pacientes con TNBC [22]. Por el contrario, la penetración limitada de células T CD8+ en el núcleo del tumor (≤100 células T CD8+/mm2) o las células T CD8+ restringidas en estroma se asociaron con microambientes inmunes tumorales fibróticos o inmunosupresores, que predijeron una supervivencia deficiente [22]. Por lo tanto, la localización espacial de las células T CD8+ es un predictor de los resultados clínicos [22]. La Fig. 2 complementaria describe la clasificación de la intensidad unicelular fuerte de NOS2/COX2 en relación con la presencia de células T CD8+ en todos los tumores. Dado el poder predictivo de la localización espacial de las células T CD8+ [22], observamos abundantes células T CD8+ restringidas en estroma (Fig. 4C) con una mayor expresión de IFNγ (Fig. 4D) en las regiones próximas a la expresión elevada de NOS2 en el tumor, lo que indica una asociación potencial entre las células T CD8+, IFNγ y la regulación de NOS2 (Fig. 4C, D). Por el contrario, la Fig. 4E-H muestra áreas con células T CD8+ limitadas, así como expresión limitada de IFNγ y NOS2. Es importante destacar que la COX2 se expresa mucho en estas regiones (Fig. 4E-H). Los coeficientes de correlación de Pearson también se determinaron y mostraron una correlación significativa entre las células tumorales que expresan NOS2hi y las células T CD8+/INFγ (Fig. 3A complementaria). Curiosamente, no se observó una linealidad significativa entre las células T CD8+/IFNγ y la expresión de COX2 tumoral (Fig. 3B complementaria). Estos resultados sugieren que las células T CD8+ podrían proporcionar una fuente de IFNγ que conduce a una mayor expresión de NOS2 en el tumor.

La estimulación de las vías oncogénicas por el NO se caracteriza por un aumento de la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT), la migración y la motilidad de las células cancerosas que culminan en la progresión de la enfermedad del cáncer y la metástasis [23, 24]. Los pacientes de esta cohorte sucumbieron a la enfermedad metastásica a pesar de que no se observó un estado de ganglios linfáticos positivos en el momento del diagnóstico. Las regiones NOS2hi estaban cerca de las células T CD8+ restringidas al estroma. Las áreas NOS2hi exhibieron pequeños grupos de tumores que parecían separarse de la lesión primaria (satellitosis), indicativos de nichos metastásicos (Fig. 5A cuadro 1, 5B y 5C). Por el contrario, la satelitosis estuvo ausente en regiones con menor expresión de NOS2 tumoral, así como menos células T CD8+ e IFNγ (Fig. 5D, E). Estos hallazgos indican que los focos de agrupación de NOS2hi podrían promover un mayor potencial metastásico, lo cual es consistente con informes anteriores [15, 25].

A Distribución espacial de todo el tumor con recuadros azules etiquetados 1 (arriba), 2 (medio) y 3 (abajo) que muestran B, C ampliación de la localización espacial de NOS2 (rojo) y las células que expresan el marcador tumoral CKSOX10 (azul) en una región NOS2hi (50 μm) resaltada en el cuadro 1. Se muestran células que expresan NOS2 alargadas y agrupadas que se han separado de la lesión más grande, lo que es indicativo de satelitosis y aumento del potencial metastásico. Estos fenotipos no se observan en regiones inmunes al frío (D) o regiones desérticas inmunes (E).

La morfología celular es un aspecto clave de la metástasis, donde las células adquieren un fenotipo alargado durante los procesos de migración e invasión. Los modelos de migración in vitro han demostrado funciones de NO durante los procesos metastásicos, donde la exposición a un flujo de NO más alto (100–300 nM) durante 24–48 h aumentó la migración in vitro y la invasión de células de cáncer de mama MB231 y MB468 [7, 15]. Estas observaciones anteriores sugieren que el aumento de la expresión y el agrupamiento de NOS2 en el tumor generaría un flujo de NO que aumenta el potencial metastásico de las células expuestas dentro de ese nicho [15]. En este documento, exploramos más a fondo la influencia de la expresión de NOS2/COX2 de células tumorales en la morfología celular alterada. Como se muestra en la Fig. 6A, B, las células MB231 expuestas a un tratamiento de citoquinas individual o combinado demostraron cambios morfológicos y elongación celular característicos de EMT en células migratorias e invasoras. Además, el ensayo de prueba de rascado mostró un mayor cierre de la herida después de 12 h de tratamiento combinado con IFNγ + TNFα en comparación con las células de control no tratadas (Fig. 6C). De manera similar, los ensayos de la cámara de Boyden mostraron una mayor invasión celular en respuesta al tratamiento combinado de IFNγ + TNFα de 48 h, que se redujo con los inhibidores pan-NOS/COX (LNAME/indometacina) tanto como agentes de tratamiento únicos como en combinación (Fig. 6D). Estos resultados sugieren que la regulación positiva de la expresión tumoral de NOS2/COX2 dentro de un nicho inflamatorio podría generar fenotipos con mayor potencial metastásico (Fig. 6).

A Imágenes de microscopio (10X) de células MB231 de control y tratadas con citoquinas durante 48 h. Análisis de elongación de células B después de 48 h de tratamiento con citoquinas. Ensayo de prueba de raspado CA de células MB231 después de 12 h de tratamiento con citoquinas. Ensayo de invasión celular D; Se sembraron células MB231 en el pocillo superior de una cámara de Boyden con medio libre de suero ± citocinas y los inhibidores de pan-NOS/COX LNAME e indometacina durante 48 h. La cámara inferior se llenó con medio completo. Las células se contaron frente a la curva estándar. Los resultados se presentan como media ± SD. *p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001.

Uno de los indicadores pronósticos más efectivos para el cáncer de mama ER- es la asociación entre NOS2 y COX2 [10, 26]. Los datos anteriores demuestran un vínculo inusual entre el IFNγ y las células linfoides en términos de resultados clínicos, como se resume en la figura 7. El IFNγ y las células T CD8+ están vinculados y son necesarios para la producción de niveles elevados de NOS2 y COX2, a pesar de que son predictivos de resultados clínicos positivos y un sello distintivo de un buen pronóstico en muchos tumores malignos [22, 27]. Según los resultados de scRNAseq, IFNγ e IL1β/TNFα son necesarios para inducir los niveles más altos de expresión de NOS2 y COX2, lo que sugiere que las células linfoides podrían ser un factor contribuyente en el tumor. Según investigaciones anteriores, IFNγ es fundamental para la estimulación de NOS2 en células DLD1 (cáncer de colon humano) [28]. Además, el scRNAseq de MB231 con IFNγ + IL1β revela una fuerte conexión entre NOS2/COX2 e IL1β, TNFα, IL6 e IL8, lo que refuerza la noción de un microambiente Th1 fortalecido adquirido del TCGA (Fig. 1). Esto implica mecanismos inmunitarios multifactoriales que conducen a un bucle de retroalimentación que promueve la inducción de nichos celulares que expresan NOS2/COX2 y la progresión de la enfermedad. Estudios previos han demostrado que IFNγ, IL6, PGE2 e IL1 potenciaron la expresión de NOS2, lo que sugiere que varios procesos de refuerzo estuvieron involucrados en la regulación positiva de NOS2 [15]. Además, la IL1α es un mediador del estrés del RE que se observa con frecuencia en el TME después de la quimioterapia. Tanto IL1α como ILβ aumentaron en respuesta a IFNγ e IL1β mejoran significativamente estas vías complementarias para la elevación sostenida de los mecanismos de NOS2/COX2. Estos factores podrían conspirar para crear un nicho inflamatorio NOS2/COX2 que promueva la progresión de la enfermedad.

La secreción de IFNγ por los linfocitos T CD8+ restringidos por el estroma y la IL1β/TNFα secretada por las células mieloides dentro del microambiente tumoral conduce a la expresión de NOS2/COX2 tumoral y al desarrollo de nichos celulares agresivos con mayor potencial metastásico y promueve la inmunosupresión. Los vecindarios celulares que expresan un alto contenido de NOS2/COX2 en el tumor luego aumentan IL1α/β, lo que crea un circuito de retroalimentación que mantiene la expresión de NOS2/COX2 en el tumor y citocinas elevadas, incluidas IL8 e IL-6, así como la activación de TGFβ latente por NO. Estos factores conspiran para promover la inmunosupresión, la metástasis y la degeneración del cáncer a través del NO derivado de NOS2 y PGE2 derivado de COX2.

A pesar de que la secuencia y la bioquímica de la proteína son comparables en el ratón y en el ser humano, el promotor de NOS2 es complicado y difiere significativamente entre las dos especies [28,29,30]. La expresión de NOS2 en macrófagos murinos inducida al máximo in vitro por IFNγ o LPS ha sido el estándar de oro en el campo del NO, donde el flujo estimado de NO podría alcanzar hasta 1–5 µM a nivel celular [13]. Las células tumorales murinas mostraron una actividad NOS2 significativamente mayor en respuesta a IFNγ o LPS, lo que sugiere una distinción clave entre las células tumorales y los macrófagos [13]. Si bien los datos aquí demuestran claramente que IFNγ, IL1β y TNFα inducen la expresión máxima de NOS2 humana, idéntica a la de las células tumorales murinas, los macrófagos humanos no activan NOS2 con IFNγ o LPS. Sin embargo, los niveles de NO producidos por células tumorales humanas y de ratón todavía difieren significativamente en un nivel fundamental. Recientemente, se demostró que el número de células NOS2+, más que la expresión de NOS2, se correlacionaba con la cantidad de NO y nitrito producidos in vitro [11]. Como resultado, los grupos de células que expresan NOS2 afectarán los niveles de NO, y el agrupamiento de células NOS2 puede producir áreas de mayor flujo de NO [13, 31]. Los experimentos in vitro revelan que los niveles altos de nitrito y NO están presentes cuando el 50-80% de las células expresan NOS2 y los flujos son superiores a 100 nM. Sin embargo, la producción de NO es un orden de magnitud menor en el 5% de los cánceres humanos. Nuestra investigación anterior demuestra que las vías carcinogénicas impulsadas por NO tienen lugar a una concentración ideal de 200 a 400 nM, lo que aumenta la expresión de IL6 e IL8 [12]. No obstante, los niveles de NO son más altos donde las células que expresan NOS2 se concentran en una densidad mucho más alta, como en focos localizados dentro del tumor. Cuando se consideran colectivamente, estos hallazgos sugieren que estas regiones de células que expresan NOS2 de alta densidad tienen un mayor flujo de NO, lo que puede desencadenar mecanismos oncogénicos que tienen lugar en el rango de 100-300 nM NO en la placa de Petri [32,33,34 ].

Las áreas enriquecidas para células T CD8+ e IFNγ están relacionadas con la yuxtaposición de células linfoides y tumorales dentro del TME, lo que da como resultado un alto agrupamiento de células que expresan NOS2 mejoradas. Un estudio anterior que analizó la ubicación de las células T CD8+ demostró que la orientación espacial es un factor crucial en la determinación de los resultados clínicos del TNBC [22]. Los resultados positivos se describen cuando el tumor penetra profundamente en las células T CD8+ en el núcleo del tumor en un tumor completamente inflamado. Por otro lado, las células T CD8+ restringidas por el estroma y las regiones desérticas inmunitarias desprovistas de células T CD8+ predicen malos resultados clínicos [22]. Aquí demostramos que se pueden formar nichos celulares NOS2 altos en el margen del tumor y proximales a las células T CD8+ restringidas al estroma. Estos nichos ahora pueden encontrar IFNγ y otras citoquinas que inducen la expresión de NOS2/COX2 en el tumor. Por el contrario, las células NOS2+ y COX2+ se dispersan y se observan en niveles más bajos en áreas con mayor penetración de células T CD8+ en el tumor. La información antes mencionada demuestra inequívocamente que las células T CD8+ y el IFNγ están cerca de NOS2 y sugiere que es necesario un nicho inflamatorio con células T CD8+ restringidas por estroma para la inducción de NOS2.

Un desierto inmunitario desprovisto de células T CD8+ es otro aspecto significativo de la TME que se ha identificado previamente [22]. Los bajos recuentos de células T CD8+ y el agotamiento de las células T CD8+ en el compartimento del tumor sugieren un mal resultado clínico [35]. Uno de los factores críticos en la ausencia de linfocitos T CD8+ asociados con niveles bajos de IFNγ en regiones desérticas inmunológicas también se reveló en regiones deficientes en NOS2 con expresión aumentada de COX2. Esto implica que el desierto inmunológico está asociado con regiones positivas para COX2 y negativas para NOS2. Las células T CD8+ elevadas y otras células linfoides que están restringidas al estroma o los márgenes del tumor pueden dar lugar a situaciones que promuevan niveles más altos de NOS2 y COX2.

Nuestra investigación anterior demostró que el NO es esencial para promover la EMT y la metástasis [15]. El aumento de la inflamación en estos focos NOS2 aumenta la probabilidad de metástasis, y el descubrimiento del nicho positivo para NOS2 en la interfaz tumor-estroma sugiere que este puede ser el sitio de la metástasis. Se sabe que el alargamiento y la EMT inducida por NO median estos efectos [15]. Además, IL1 y PGE2 mejoran la EMT y la motilidad celular en el cáncer de mama [36, 37]. Aquí, IFNγ e ILβ1/TNFα promueven la motilidad y el alargamiento [7]. Como resultado, los nichos inflamatorios de NOS2/COX2 aumentan el potencial de motilidad de las células cancerosas y diseminación metastásica. Por lo tanto, se puede lograr un potencial metastásico limitado mediante la inhibición de los bucles de realimentación de NOS2/COX2 [38]. Dado que la metástasis es la principal causa de muerte por cáncer, la localización espacial de NOS2/COX2 en estos sitios de inflamación podría proporcionar un indicador de pronóstico temprano de mal resultado, incluso en ausencia de un estado de ganglios linfáticos positivos [7].

IFNγ juega un papel clave en la inducción de respuestas inmunes antitumorales proinflamatorias [39]. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la respuesta de IFNγ depende de la concentración donde los niveles bajos en el TME promueven la progresión de la enfermedad protumorigénica mediada en parte por la regulación a la baja de los complejos principales de histocompatibilidad y la regulación al alza de la indolamina 2,3-dioxigenasa y el ligando 1 de muerte celular programada [39] . Además, el IFNγ es necesario para estimular la expresión de NOS2/COX2 específica del tumor, que a través de un proceso multifacético también impulsa las vías oncogénicas y da forma a los perfiles inmunológicos asociados con un mal pronóstico [10, 11]. Dado que el IFNγ es secretado por las células T CD8+ citolíticas, el análisis espacial sugiere que la cantidad y la ubicación de las células T CD8+ [22] presentan una oportunidad para la formación de procesos reguladores de IFNγ dentro del TME, incluida la regulación positiva de la expresión tumoral de NOS2/COX2 y el desarrollo de nichos que promueven la progresión de la enfermedad, la metástasis y los malos resultados clínicos [7, 10, 11, 22].

La línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB231 (MB231) se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivó en RPM1-1640 (Invitrogen) complementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS; Invitrogen, Waltham, MA) a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 en el aire. Las células se privaron de suero durante la noche antes de la experimentación. Según los ensayos posteriores, las células se incubaron durante 12, 24 o 48 h con la adición de ddH2O (control), IFNγ 100 U/mL (285-IF/CF, R&D Systems, Minneapolis, MN), IL1β 10 ng /mL (201-LB/CF, R&D Systems), TNFα 10 ng/mL (210-TA/CF, R&D Systems), IL17A 10 ng/mL (7955-IL-CF, R&D Systems), lipopolisacárido (LPS, Sigma , St. Louis, MO) 10 mg/ml (L2630, Sigma), LNAME 500 mM (N5751, Sigma, St. Louis, MO) y/o indometacina 100 μM (I7378, Sigma, St. Louis, MO).

Se sembraron un millón de células en una placa de 60 mm y se permitió que alcanzaran el 100 % de confluencia. Se usó una punta de pipeta de 200 μl para grabar una línea de rascado recta a través de la monocapa confluente. Las células flotantes y muertas se eliminaron lavando las placas en PBS 1X y luego se añadió medio completo. Se utilizó un microscopio invertido con objetivo 10x (EVOS, Life Technologies, Carlsbad, CA) para tomar imágenes a las 0, 4, 8 y 12 h. El software de código abierto ImageJ midió el ritmo al que se rellenan los espacios vacíos (versión 1.53 u) [40].

Se utilizó un ensayo de invasión celular (cat# ab235697) en formato de placa de 96 pocillos de Abcam (Waltham, MA). Después de la sincronización celular, se administró un medio completo a la cámara inferior como atrayente y se sembraron 50.000 células en la cámara superior con inhibidores de citocinas ± durante 48 h. Las células fluorescentes migradas se contaron a Ex/EM = 530/590 nm en un lector de placas SpectraMax i3x (Molecular Devices, San Jose, CA) y se compararon con una curva estándar hecha a partir de la misma línea celular.

La biblioteca de células individuales se generó con el kit de reactivos 3' de células individuales 10x Genomics (San Francisco, CA) v3 y luego se secuenció en nuestras instalaciones de secuenciación (NCI en Frederick, MD) con Illumina NovaSeq 6000. Células de muestra en un medio de suspensión se examinó la viabilidad antes de la preparación de la biblioteca. Los cDNAs fueron secuenciados después de ser codificados, agrupados y amplificados durante la preparación de la biblioteca. En promedio, se secuenciaron 10.000 células por muestra. El software Cell Ranger proporcionó lecturas sin procesar como entrada (10x Genomics, versión 6.1.2). Fueron demultiplexados y convertidos en archivos BCL utilizando Cell Ranger. Todas las lecturas se mapearon en el genoma de referencia humano utilizando el canal de genómica 10x predeterminado (versión 3.1.0) después de pasar los controles de calidad (GRCH38-30.0). Se usaron recuentos de transcritos anotados dentro de cada celda para construir matrices de recuento UMI (Unique Molecular Identifier).

Los archivos de la matriz h5 para cada muestra se cargaron en el servidor Flow interno de Partek (St. Louis, MO) para el procesamiento y la extracción de datos. Todos los recuentos se normalizaron utilizando el método predeterminado "recuentos por millón, sumar 1 y transformar log2". Luego se aplicó la herramienta GSA (análisis específico de genes) para descubrir genes que se expresaron de manera diferencial entre las diversas muestras experimentales. Se usaron cambios de pliegue absolutos ≥2 y un valor de p <0.05 para seleccionar genes. Utilizamos el navegador Loupe (versión 6.3.0, 10 × Genomics) para inspeccionar visualmente los conjuntos de datos agregados e independientes para analizar los patrones de agrupación de los datos scRNAseq. Para crear mapas de calor de correlación, se exportaron a RStudio (2022.07.2 Build 576, https ://posit.co/) en paralelo. Los datos de una sola celda están disponibles previa solicitud al autor de correspondencia.

Se accedió al subconjunto de cáncer de mama (BRCA) de TCGA (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga) a través de la UCSC (Universidad de California, Santa Cruz) Xena Navegador (Fecha de acceso: 2/11/2022, https://xena.ucsc.edu/). En resumen, todos los genes de citocinas Th1, Th2, Th17, NOS2 y COX2 seleccionados se examinaron en el navegador Xena y luego se exportaron a RStudio (2022.07.2 Build 576) para el análisis de correlación posterior.

Se obtuvieron muestras tumorales (n = 21) de pacientes con cáncer de mama reclutadas en el Centro Médico de la Universidad de Maryland (UMD), el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Baltimore, el Hospital Union Memorial, el Centro Médico Mercy y el Hospital Sinai en Baltimore entre 1993 y 2003 . El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. La Junta de Revisión Institucional (IRB) de la UMD revisó y aprobó la recopilación de muestras de tumores, datos de encuestas e información clínica y patológica (protocolo de la UMD n.º 0298229) para las instituciones participantes. La investigación también fue revisada y aprobada por la Oficina de Investigación de Sujetos Humanos de los NIH (OHSR n.º 2248). La expresión de NOS2 y COX2 en tumores de mama se analizó previamente mediante IHC usando anticuerpo NOS2 diluido 1:250 y anticuerpo COX2 diluido 1:50 (n.º 610328 y 610204, respectivamente, BD Biosciences, San Diego, CA) y un patólogo calificó [7, 9]. Para la tinción de NOS2, se utilizó una puntuación combinada de intensidad y distribución para categorizar las tinciones inmunohistoquímicas de NOS2, donde la intensidad recibió una puntuación de 0 a 3 si la tinción era negativa, débil, moderada o fuerte. La distribución NOS2 recibió puntajes de 0 a 4 para distribuciones <10 %, 10 a 30 %, >30 a 50 %, >50 a 80 % y >80 % de células positivas [7]. Para la tinción de COX2, las puntuaciones de negativas a débiles [1, 2] o de moderadas a fuertes [3, 4] se clasificaron como bajas o altas, respectivamente [9]. En este documento, las expresiones de NOS2 y COX2 también se analizaron mediante tinción fluorescente realizada en el Bond RX Autostainer XL ST5010 de Leica Biosystems (Wetzlar, Alemania) utilizando el kit Bond Polymer Refine (Leica Biosystems DS9800), con la omisión del reactivo Post Primary Block, DAB y hematoxilina. Después de la recuperación del antígeno con EDTA (Bond Epitope Retrieval 2), las secciones se incubaron durante 30 min con COX2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, no. 12282, 1:100), seguido del reactivo Polymer y OPAL Fluorophore 520 (AKOYA, Marlborough, MA). El complejo de anticuerpos COX2 se eliminó calentando con Bond Epitope Retrieval 2. Luego, las secciones se incubaron durante 30 min con el anticuerpo NOS2 (Abcam no. ab15323, 1:50), seguido del reactivo de polímero y el fluoróforo OPAL 690. El complejo de anticuerpos NOS2 se se decaparon calentando con Bond Epitope Retrieval 2 y luego se tiñeron con CD8 (Abcam n.° 101500, 1:100) o IFNγ (Abcam n.° 231036, 1:200), seguido del reactivo Polymer y OPAL Fluorophore 570. Las secciones se tiñeron con DAPI y cubreobjetos con Prolong Gold Anti-Fade Reagent (Invitrogen). Las imágenes se capturaron utilizando el escáner de diapositivas completas Aperio ScanScope FL (Leica). La IHC original informada previamente [7, 9] y los resultados de la tinción fluorescente con NOS2/COX2 fueron generalmente consistentes.

El tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) seccionado a 4 μm y montado en portaobjetos SuperFrost Plus se tiñó con un kit FixVUE Immuno-8TM (anteriormente conocido como kits UltiMapper® (Ultivue Inc., Cambridge, MA), EE. UU.; CD8 , NOS2, COX2, CKSOX10 y cóctel de IFNγ) utilizando el método de inmunofluorescencia multiplexada (mIF) con código de barras de ADN conjugado con anticuerpos [1]. Estos kits incluyen los tampones y reactivos necesarios para ejecutar los ensayos: diluyente de anticuerpos, mezcla de preamplificación, enzima y tampón de amplificación, sondas fluorescentes y el tampón correspondiente, y reactivo de contratinción nuclear. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y mIF se realizó con Leica Biosystems BOND RX Autostainer. Antes de realizar la tinción con mIF, las secciones de tejido FFPE se hornearon verticalmente a 60–65 °C durante 30 min para eliminar el exceso de parafina antes de cargarlas en el BOND RX. Se utilizó BOND RX para teñir los portaobjetos con el protocolo FixVUE (UltiMapper) recomendado. Durante la configuración del ensayo, los reactivos del kit se prepararon y cargaron en el Autostainer en contenedores de titulación Leica. Las soluciones para la recuperación de epítopos (ER2, Leica Biosystems cat# AR9640), BOND Wash (Leica Biosystems cat# AR9590), junto con todos los demás reactivos a granel BOND RX, se adquirieron de Leica). Durante este ensayo, primero se incubó la muestra con una mezcla de los cuatro conjugados de anticuerpos, luego se amplificaron simultáneamente los códigos de barras de ADN de cada objetivo para mejorar la sensibilidad del ensayo. A continuación, se añadieron a la muestra sondas fluorescentes conjugadas con códigos de barras de ADN complementario para unir y marcar los objetivos; A continuación, se utilizó un paso de eliminación de señal suave para eliminar las sondas fluorescentes de los marcadores. Los portaobjetos teñidos se montaron en medio de montaje Prolong Gold Anti-Fade (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, cat# P36965 y se cubrieron con cubreobjetos (Fisherbrand Cover Glass 22 × 40 mm, #1.5). Las imágenes digitales de inmunofluorescencia se escanearon con un aumento de 20x. Imágenes fueron co-registrados y apilados con el software Ultivue UltiStacker.Luego, las imágenes digitales se analizaron utilizando la plataforma de análisis de imágenes HALO [41].

Los experimentos se ensayaron por triplicado a menos que se indique lo contrario. Se empleó la prueba t de Student para evaluar la significación estadística utilizando el software GraphPad Prism (versión 9). Los análisis de imágenes se informan como media ± SEM y se usaron pruebas T con corrección de Welch o Mann-Whitney cuando fue apropiado para determinar la importancia. También se realizaron análisis lineales y correlaciones de Pearson para determinar correlaciones significativas entre las expresiones de proteínas utilizando el software Prism. La significancia se informa como *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 y ****p ≤ 0,0001. Los análisis de correlación de una sola celda se realizaron en RStudio utilizando el diagrama de corrupción (0.92) en R (4.2.1).

Los datos de RNAseq de una sola célula estarán disponibles a pedido.

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Este proyecto fue financiado en su totalidad o en parte con fondos federales del Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional del Cáncer, CCR, CIL (RYSC, LAR, ALG, ELF, HR, VS, RJK, SMH, DWM, SKA, SA y DAW). Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Laboratorio Nacional de Investigación del Cáncer de Frederick, Institutos Nacionales de Salud, bajo el contrato HHSN261200800001E (ALW, WFH, MP, SKA y SJL) y el Programa de Ciencias Básicas, Laboratorio Nacional de Investigación del Cáncer de Frederick , Frederick, MD 21702 (SKA). Este proyecto fue financiado en parte por las subvenciones 2018/08107-2 y 2021/14642-0 (MCR) de la São Paulo Research Foundation (FAPESP), NIH R01CA238727, NIH U01CA253553 y John S Dunn Research Foundation (STCW), NCI grant no. U54 CA210181, Breast Cancer Research Foundation (BCRF), Moran Foundation, Causes for a Cure, apoyo filantrópico de M. Neal y R. Neal, y Center for Drug Repositioning and Development Program (CREDO) (JCC), Science Foundation Subvención de Irlanda (SFI) número 17/CDA/4638, y una subvención de SFI y del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) número 13/RC/2073 (SAG). Queremos agradecer a la Fundación São Paulo de Pesquisa (FAPESP) por el envío de estudiantes al exterior (LC). El contenido de esta publicación no refleja necesariamente los puntos de vista ni las políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica la aprobación por parte del gobierno de los EE. UU.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Estos autores contribuyeron igualmente: Robert YS Cheng, Lisa A. Ridnour.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Stephen J. Lockett, Stefan Ambs, David A. Wink.

Laboratorio de Innovación del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, Frederick, MD, EE. UU.

Robert YS Cheng, Lisa A. Ridnour, Ana L. González, Elise L. Femino, Helene Rittscher, Veena Somasundaram, Daniel W. McVicar, Stephen K. Anderson y David A. Wink

Laboratorio de Análisis y Microscopía Óptica, Laboratorio Nacional de Investigación del Cáncer de Frederick, Leidos Biomedical Research Inc. para el Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, MD, EE. UU.

Adelaide L. Wink, William F. Heinz y Stephen J. Lockett

Centro de Investigación Traslacional en Oncología, ICESP/HC, Facultad de Medicina, Universidad de São Paulo; y Centro Integral de Oncología de Precisión, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brasil

Leandro Coutinho & M. Cristina Rangel

Laboratorios de histopatología molecular, Leidos Biomedical Research Inc. para NCI, Frederick, MD, EE. UU.

Elijah F. Edmondson y Donna Butcher

Oficina del Director, División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer, NCI, Frederick, MD, EE. UU.

Robert J. Niños

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Universidad de Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Xiaoxian Li

Departamento de Medicina de Sistemas y Bioingeniería, Houston Methodist Neal Cancer Center, Houston Methodist Hospital y Weill Cornell Medicine, Houston, TX, EE. UU.

Esteban TC Wong

Laboratorio de citometría masiva de imágenes, Programa de tecnología de investigación del cáncer, Laboratorio Nacional de Investigación del Cáncer de Frederick, Frederick, MD, EE. UU.

poro suave

Laboratorio de Patología CCR, NCI, NIH, Bethesda, MD, EE. UU.

Esteban M. Hewitt

Departamento de Cirugía, Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, 15213, EE. UU.

Timoteo R. Billiar

Disciplina de Patología, Instituto Lambe de Investigación Traslacional, Facultad de Medicina, Universidad de Galway, Galway, Irlanda

Sharon A. Glynn

Centro de Cáncer Mary and Ron Neal, Hospital Metodista de Houston y Medicina Weill Cornell, Houston, TX, EE. UU.

Jenny C.Chang

Laboratorio de Carcinogénesis Humana, CCR, NCI, NIH, Bethesda, MD, EE. UU.

Stefan Ambs

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RYSC y LAR: escribieron artículos, realizaron experimentos y análisis de datos. ALW: datos analizados. ALG, ELF, LC, MP, SMH y SA: realizaron experimentos y análisis de datos. HR, VS y DB: experimentos realizados. WFH, EFE, RJK, XL, STCW, DWM, SKA, TRB, SAG, JCC y SJL: análisis de datos. MCR: reactivos proporcionados. DAW: escribió papel y análisis de datos.

Correspondencia a David A. Guiño.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Editado por el Dr. Pier Giorgio Mastroberardino

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Reimpresiones y permisos

Cheng, RYS, Ridnour, LA, Wink, AL et al. El interferón-gamma es fundamental para la expresión de NOS2 y COX2 en tumores de mama ER- que conducen a un mal resultado. Muerte celular Dis 14, 319 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-05834-9

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Recibido: 05 Diciembre 2022

Revisado: 20 de abril de 2023

Aceptado: 24 abril 2023

Publicado: 11 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-023-05834-9

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